在哺乳动物早期胚胎发育的过程中，会发生大规模的表观基因组重编程【1】。发育过程中胞嘧啶残基的DNA甲基化（DNAme）主要通过在CpGs位点引入5-甲基胞嘧啶 (5-methylcytosine, 5mC) ，从而控制转录因子与DNA结合【2】，这一机制在基因调控中发挥着关键作用。参与维持DNAme的分子主要是DNMT3A，DNMT3B和DNMT3L，而在DNA复制过程中DNMT1和UHRF1主要参与DNAme在基因组上的增殖 【3】。

在胚胎早期阶段，胚胎多能性的退出是以胚胎的上胚层从着床前向着床后过渡为特征的。在这个转变过程中，全基因组DNAme由从头DNA甲基转移酶DNMT3A和DNMT3B建立，并且其表达水平显著升高，从而影响细胞命运的调控【4】。在小鼠中，Dnmt3a敲除导致出生后死亡，而Dnmt3b敲除导致胚胎致死，表明这两种DNMTs具有不同的生物学功能【5】。然而，这两种DNMTs参与细胞定向分化的分子靶点尚不清楚。

2023年1月23日，意大利都灵大学Salvatore Oliviero教授团队在Nature Communications在线发表题为DNMT3B supports meso-endoderm differentiation from mouse embryonic stem cells 的研究论文，通过体外胚胎干细胞分化和基因功能缺失实验，结合高通量全基因组亚硫酸氢盐测序、普通转录组和单细胞测序，首次剖析了DNMT3B在细胞命运调控中的特异性功能。

胚胎干细胞（ESCs）和上胚层干细胞（EpiLCs）分别代表胚胎着床前和着床后的naïve（原始态）和primed（始发态）两种状态。ESCs具有低水平的从头DNMTs，高水平的DNMT3L，TET1和TET2，以及普遍的低甲基化水平，而EpiLCs则表达高水平的从头DNMTs和急剧升高的甲基化水平。为了探究DNAme在干细胞命运决定中的特定作用，该论文研究了Dnmts缺失的ESCs从多能性退出时的分化发育轨迹。首先通过体外embryoid body分化技术，研究人员发现WT、3AKO 细胞具备分化成外、中、内三胚层的能力，而3BKO 细胞则在向中内胚层分化时有明显缺失（图1）。该结果可能解释了小鼠Dnmt3b基因敲除胚胎在体内因中内胚层来源的组织缺陷而观察到的早期胚胎致死，而Dnmt3a基因敲除小鼠只在出生后死亡。

图1. Dnmt3b缺失影响ESC向embryoid body分化

接下来，为了进一步探究DNMT3B介导的DNA甲基化在细胞定向分化中的作用，如图2所示，研究人员开发了体外干细胞向中内胚层定向分化的实验方法，通过转录组测序发现在EpiLCs中DNMT3B的缺失导致外胚层基因的异常上调，影响中内胚层谱系的分化。结合全基因组甲基化水平分析，研究人员发现3BKO细胞中的低甲基化位点与神经外胚层分化标志基因，如Sox1、Sox2、Olig3和Tubb3密切相关，这与从小鼠胚胎早期阶段获得的数据一致。这表明，DNMT3B依赖的DNA甲基化通过抑制关键转录因子的表达来建立中内胚层表观遗传景观，否则这些转录因子将诱导默认分化为神经外胚层。

图2. DNMT3B的缺失影响EpiLCs向中内胚层转化的关键调控区域的DNA甲基化水平

最后，通过多组学关联分析结合转录因子靶点数据库信息，研究人员对DNMT3B直接靶点的分析主要集中在Sox2上，Sox2是一个著名的主调控因子，可对抗Brachyury促进神经外胚层分化【6】。DNAme分析结果显示Sox2超级增强子在3BKO EpiLCs中甲基化水平显著降低，导致Sox2表达上调。此外，研究人员利用CRISPRoff新型基因编辑技术，对Sox2超级增强子区域进行靶向甲基化编辑，揭示了Sox2增强子元件的DNA甲基化是影响其表达水平下调的原因。

综上所述，该项研究揭示了在EpiLCs阶段DNMT3B介导的甲基化对中胚层-内胚层谱系定向分化的启动至关重要，并在EpiLCs谱系确定过程中提供了从头DNMTs的功能特征。这些发现加深了对干细胞研究领域的理解，或许对疾病模型的建立和干细胞疗法的推动发挥积极作用。

参考文献

1. Zernicka-Goetz, M. et al. Making a firm decision: multifaceted regulation of cell fate in the early mouse embryo. Nat Rev Genet 10, 467–477 (2009).

2. Yin, Y. et al. Impact of cytosine methylation on DNA binding specificities of human transcription factors. Science 356, (2017).

3. Chen, Z. & Zhang, Y. Role of Mammalian DNA Methyltransferases in Development. Annu Rev Biochem 89, 1–24 (2019).

4. Borgel, J. et al. Targets and dynamics of promoter DNA methylation during early mouse development. Nat Genet 42, 1093–1100 (2010).

5. Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 99, 247–257 (1999).

6. Koch, F. et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Dev Cell 42, 514-526.e7 (2017).